B型肝炎即乙型肝炎是一种由乙型肝炎病毒（HBV）感染人体引起的传染性疾病，以肝脏病变为主。对于慢性乙型肝炎病毒感染者进行治疗一般使用核苷类似物和干扰素类药物。然而，这些药物往往需要长期甚至终生用药，而且有耐受性的问题。

RNA干扰（RNAi）是一种新兴的药物治疗方法，其原理是利用RNA分子通过破坏目标基因的信使RNA（mRNA）来抑制疾病相关基因的表达。RNAi疗法已经被广泛应用于探索基因功能和传染性疾病及恶性肿瘤的基因治疗领域。RNAi疗法对乙肝新药的研究意义重大，有望成为效治愈乙肝的新疗法。

乙型肝炎病毒的四个开放阅读框(ORF)分别编码前核心/核心、聚合酶、表面和X蛋白。这四个ORF具有重叠序列，并且在核心蛋白编码区的3'端具有相同的多聚腺苷酸化信号。这使得单个siRNA即可干扰所有四种HBV转录物。对于乙肝病毒的RNAi疗法已经进行了大量研究，形成了一些有望用于乙肝新药开发的候选RNAi疗法的专利技术。阿尔尼拉姆医药品有限公司的专利号ZL201580072874.0名称为“B型肝炎病毒(HBV)iRNA组合物及其使用方法”就是其中之一。

对于该专利ZL201580072874.0，请求人张媛于2021年12月31日向国家知识产权局提出了无效宣告请求。请求人给出的理由如下：权利要求1-41不清楚；权利要求1-10、12-41得不到说明书的支持；说明书公开不充分；权利要求1-41缺乏创造性。

针对请求人的无效请求，专利权人修改了权利要求，其中将权利要求2的技术特征加入权利要求1中，删除了原权利要求3中涉及术语“脱氧-核苷酸”、“锁核苷酸”、”无碱基核苷酸”、“2’‑羟基‑修饰的核苷酸”、“2’-O-烷基-修饰的核酸”和“包含非天然碱基的核酸”的技术方案。

国家知识产权局在审理后于2022年10月10日作出无效宣告请求审查决定，在专利权人提交的修改权利要求的基础上维持专利权部分有效。

修改后的权利要求1-2如下：

“1，一种用于抑制细胞中B型肝炎病毒(HBV)表达的双链RNAi剂，其中该双链RNA剂包含形成双链区的正义链与反义链，

其中该正义链包含5’-GUGUGCACUUCGCUUCACA-3’（SEQ ID NO:39)且所述义链的长度不超过21个核苷酸，且该反义链包含5’-UGUGAAGCGAAGUGCACACUU-3’(SEQ ID NO:40)且所述反义链的长度不超过23个核苷酸，

其中该正义链的所有核苷酸及该反义链的所有核苷酸为经修饰的核苷酸，

其中该正义链与在3’-末端附接的配体缀合，且

其中该配体为一种或多种利用二价或三价的分支键联体附接的GalNAc衍生物。

2.如权利要求1所述的双链RNAi剂，其中至少一个该经修饰的核酸是选自下组，该组由以下各项组成：3’-末端脱氧-胸腺嘧啶(dT)核苷酸、2’-O-甲基修饰的核苷酸、2’-氟修饰的核苷酸、2’-脱氧-修饰的核苷酸、锁核苷酸、非锁核苷酸、构型限制性核苷酸、限制性乙基核苷酸、无碱基核苷酸、2‘-氨基-修饰的核苷酸、2’-O-烯丙基-修饰的核苷酸、2’-C-基-修饰的核苷酸、2’-羟基-修饰的核苷酸、2’-甲氧基乙基修饰的核苷酸、吗啉基核苷酸、氨基磷酸酯、四氢呲喃修饰的核苷酸、1,5-脱水已糖醇修饰的核苷酸、环己烯基修饰的核苷酸、包含硫代磷酸酯基的核苷酸、包含甲基膦酸酯基的核昔酸、包含5’-磷酸酯的核苷酸、及包含5’-磷酸酯模拟物的核苷酸。

基于修改的权利要求，本专利权利要求的核心是以开放式的方式限定的双链RNAi序列，其中限定了双链RNAi正义链和反义链的核心序列，并且限定了序列的长度。本专利权利要求还限定了正义链的所有核苷酸及反义链的所有核苷酸包含修饰；限定了正义链在3’‑末端缀合有配体，并进一步限定了配体的类型和连接方式。

本专利说明书中给出了两个具体双链RNAi的实验数据，这两个具体双链RNAi具有权利要求1中限定的dsRNA一级序列，正义链的3’‑末端连接有GalNAc配体，且所有核酸包含修饰，修饰类型为2’-O-甲基化、2’-氟代和硫代磷酸酯键联基。

本案关注的焦点是双链RNAi药物相关专利的保护范围概括是否合理、说明书是否充分公开、发明创造性高度等问题。

具体而言，请求人提出：

1）权利要求得不到说明书支持。更具体地，本专利权利要求中限定了正义链的所有核苷酸及反义链的所有核苷酸包含修饰，但未限定修饰的具体类型、位点、数量，因此认为权利要求限定的保护范围不清楚。本专利权利要求中以包含的开放式术语限定双链RNAi序列，本领域技术人员无法确定验证序列之外的哪些序列可以保留与所验证的修饰序列类似的RNA干扰活性。权利要求中限定了正义链在3’‑末端缀合有一种或多种GalNAc衍生物，但除了说明书中记载的L967配体之外，本领域技术人员无法预先确定采用哪些其它分支键联体结构的配体的经修饰双链RNAi剂能达到相近的技术效果。

2）说明书公开不充分。更具体地，说明书未公开权利要求1所涉及的双链RNAi剂的正义链或反义链“实质上所有核替酸为经修饰的核苷酸”的技术方案；说明书未公开权利要求3中除了2’-O-甲基化、2’-氟代、硫代磷酸酯键联基三种修饰类型以外的修饰类型的并列技术方案。不同实验结果之间存在矛盾，由此有理由怀疑上述实验数据的真实性，进而无法确认本发明的技术效果。

3）权利要求不具备创造性。更具体地，证据13公开了用于抑制乙型肝炎病毒表达的候选dsDNA，其中有dsDNA与本专利权利要求中限定的双链RNAi在一级序列上仅包括核心序列的一个碱基对不同，和反义链末端的两个碱基不同。证据13和其他对比文件给出了这些区别特征的结合启示。而且，对比文件也给出了其他区别特征（即修饰方式以及配体的种类和连接方式）的结合启示。

就这些问题，无效决定中的观点如下:

1）关于双链RNAi序列专利的保护范围

对于权利要求是否清楚的问题，如果基于本领域的常规技术知识和专利申请文件的记载，所属领域技术人员能够理解权利要求中所记载的技术特征所表达的含义，则所述技术特征不会导致权利要求的保护范围不清楚。对于权利要求是否得到说明书的支持的问题，进行判断时应当站在所属领域技术人员的角度上，依据其所掌握的技术知识，充分参考相关的现有技术信息，并结合说明书的全部内容予以考虑，而不应仅限于具体实施方式部分的内容。

就本案而言，就有关清楚性的问题，修改后的权利要求中限定了正义链的所有核苷酸及该反义链的所有核苷酸包含修饰。本专利说明书公开了本专利技术方案中针对iRNA（例如dsRNA）的正义链和反义链进行核酸修饰的目的、作用和主要类型，明确了经过化学修饰以加强稳定性或其他有利特性的技术构思，还详细列举了可选的修饰类型以及参照的相应现有技术文献。基于本领域的常规技术知识和专利申请文件的记载，本领域技术人员能够理解权利要求所述“所有核苷酸包含修饰”这一表述的准确含义。

就有关支持的问题，权利要求中限定了双链RNAi序列的正义链和反义链的核心序列以及它们的长度。具体而言，权利要求中限定了双链RNAi序列的正义链核心序列的19个核苷酸且其长度不超过21个核苷酸；双链RNAi序列的反义链核心序列的21个核苷酸且其长度不超过23个核苷酸。权利要求中还限定了在双链RNAi序列的正义链的3’‑末端缀合有配体，并进一步限定了所缀合的配体的类型为一种或多种GalNAc衍生物，配体的连接方式为二价或三价的分支键。

首先，本领域公知siRNA的体外沉默效应主要取决于一级序列，在siRNA的一级序列的结构确定情况下，为了加强siRNA的稳定性，具体选择何种修饰基团是本领域技术人员基于现有技术教导可以实现的。其次，双链RNAi治疗以相应dsRNA核心序列与靶RNA的序列互补性为前提，本领域技术人员基于本专利说明书的系统记载，结合常规技术手段加以选择验证，有能力在dSRNA核心序列的两端添加一到两个核苷酸，形成突出端等结构，并且维持相应的基本功能活性。最后，本专利说明书公开了可选配体的种类、性能、连接方式等信息，现有技术中针对GalNAc衍生物作为siRNA配体的研究亦可提供参考，本领域技术人员有能力获得siRNA的合适GalNAc配体及其连接方式，并且维持siRNA相应的基本功能活性。

2）说明书是否充分公开

发明充分公开应理解为，所属技术领域的技术人员根据申请公开的技术内容可以实现该技术方案，解决其技术问题，并产生预期的技术效果。

就本案而言，权利要求中已经限定了dsRNA的一级序列，本领域技术人员能够预期，具有权利要求中所限定序列的修饰dsRNA能够有效抑制细胞中B型肝炎病毒（HBV）的表达，说明书充分公开了权利要求中限定序列的修饰dsRNA的预期技术效果。生物医药学科属于典型的实验科学，对于说明书实验数据的真实性和证明力，通常需要有针对性地结合所属领域技术常识、整体现有技术状况、说明书记载的实验条件和衡量标准等，在充分考量影响实验数据的各方面因素的情况下进行综合分析评判，说明书实验数据与理论预期存在一定偏差的事实并不必然证明该实验数据完全不可信。

3）发明创造性高度

在评判发明创造性的技术启示时，需要重点关注在未得知发明技术方案的前提下，所属领域技术人员仅基于现有技术的教导是否有动机改进现有技术以获得发明的技术方案，而不是在知晓了发明的技术方案之后，再去考虑基于现有技术进行这种改进的可能性或可行性。同时，在判断是否有动机将两篇或多篇现有技术结合从而得到发明的技术方案时，应当充分分析所属领域技术人员对于引入区别技术特征以解决发明实际解决的技术问题是否存在合理的成功预期；如果无法预见两者或者多者结合后将产生的结果，则通常难以产生有目的结合的动机。

就本案而言，本专利权利要求与最接近对比文件有四个区别技术特征。四个区别技术特征分别是：核心序列的碱基对不同，反义链末端的两个碱基不同，修饰方式不同，有无连接配体。尽管这些区别技术特征在包括最接近对比文件在内的不同对比文件中均有述及，但不应把这些区别特征割裂开来看待。这些区别特征涉及序列结构特征的几个不同方面，只有综合考量才能客观分析siRNA分子的构效关系。以最接近对比文件中公开的靶向乙型肝炎病毒基因的dsRNA修饰序列作为发明起点，本领域技术人员难以想到在其基础上进行结构改进，以便获得有效抑制细胞中B型肝炎病毒（HBV）表达的双链RNAi剂。就siRNA的一级序列设计而言，对比文件中仅一般性地公开了可选的siRNA设计规则，但本身既未教导将其用于所记载的特定dsRNA修饰序列，也未明确各种规则的优先适用顺序和方式；对比文件中公开了在众多基于靶标序列的可能siRNA中进行选择的规律，但这并非设计siRNA序列的明确原则，在将其应用于siRNA设计的实践中尚需甄选确认，且本专利最接近的现有技术中的dsRNA修饰序列不满足以上证据所列的诸多选择规则。因此，本领域技术人员没有动机在最接近的现有技术的基础上参照以上对比文件的选择规则来进行结构改进和修饰。本专利权利要求中保护的双链RNAi剂能够有效抑制细胞中B型肝炎病毒（HBV）表达，这是本专利有针对性和方向性进行的大量实验筛选获得的结果，效果是基于现有技术难以预期的。进一步来说，本专利通过一级序列改构、核甘酸修饰以及配体选择等核心技术手段的联合应用，实现了活性与体内稳定性的平衡，使得体内活性持续时间有效延长。

通过本案，我们可以了解确定涉及基因序列的权利要求保护范围的合理边界的思路。对于涉及基因序列的发明而言，通过基因序列限定的发明的创造性、是否得到说明书的支持以及是否被说明书充分公开是专利撰写中的难点。涉及基因序列的发明在实质审查阶段经常会被要求限定到实施例中验证其效果的序列所对应的技术方案。对于这样的限定方式，由于保护范围过窄，通常不能反映发明人对现有技术做出的贡献，申请人/专利权人获得的权利也大打折扣。在本案中，无效决定从技术原理出发进行分析，以技术原理阐释权利要求保护范围，给出了判断此类权利要求的保护范围时需考量“序列所要实现的功能”、“通常是否会在其两端添加不同的序列”、“可能添加的序列对其原有功能的影响”等要素的意见。本案最终支持在权利要求中允许对核心序列之外的序列进行扩展，根据发明人的技术贡献对权利要求的保护范围进行适当的延展。这样的确定权利要求保护范围边界的思路同样适用于抗体相关的发明专利。在抗体相关发明专利中，利用六个CDR序列限定要求保护的抗体是比较常见的限定方式。

本案对于与现有技术相比基因序列的差异能否带来技术方案的创造性给出了判断思路。单从基础短序列的结构看，本专利和最接近的现有技术只有一个核苷酸不同。在评判基因序列差异的技术启示时，需要重点关注在未得知发明技术方案的前提下，本领域技术人员仅基于现有技术的教导是否有动机改进现有技术以获得发明的技术方案；同时在判断是否有动机将两篇或多篇现有技术结合从而得到发明的技术方案时，应当充分分析对于引入序列差异以解决发明实际解决的技术问题是否存在合理的成功预期。同时，对于涉及基因序列的技术方案的创造性，除了考虑与现有技术在一级序列方面的差异之外，还应综合考虑与现有技术在基因序列中的核苷酸修饰以及缀合的配体方面的差异。考虑所有区别技术特征带来的技术效果是否可预期，是否超出本领域技术人员的合理预期。因此，对于涉及基因序列的发明创造而言，除了重点考虑一级序列的结构特征之外，还应考虑其他方面的结构特征，以及这些结构特征综合带来的技术效果。